湖北大学生命科学学院、省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室郭瑞庭教授团队在Journal of Hazardous Materials，发表了题为“Cryo-EM structure and rational engineering of a superefficient ochratoxin A-detoxifying amidohydrolase”（一种赭曲霉毒素A高效脱毒酰胺水解酶的冷冻电镜结构与理性改造）的研究论文。
“依托湖北大学冷冻电镜平台，我们解析了分辨率为2.5-2.7 Å的酰胺水解酶ADH3及其与赭曲霉毒素A复合体的冷冻电镜结构，揭示了ADH3催化赭曲霉毒素A水解脱毒的分子作用机制；基于ADH3与赭曲霉毒素A复合体的高分辨率结构模型，对酶分子进行理性设计与改造，在短时间内实现了ADH3的快速进化，酶活提高将近4倍，体现了结构生物学在指导酶分子改造中的巨大应用价值。”本文通讯作者陈纯琪教授表示。
赭曲霉毒素A严重威胁食品安全与人类健康
赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）是由曲霉属、青霉属等有害真菌合成的毒性次级代谢产物，产生于小麦、玉米、茶叶、咖啡等农作物的田间生长、采后储藏、生产加工等多个环节（图1A），具有致癌、致突变、致畸形等毒副作用，严重威胁人类和牲畜健康，给全球食品和农牧业造成了巨大的经济损失。
赭曲霉毒素A含量是食品质量与安全的重要控制指标，联合国粮农组织和世界卫生组织建议赭曲霉毒素A的周摄入量不超过100 ng/kg体重，我国食品安全国家标准规定了谷物等粮食及制品中赭曲霉毒素A的限量标准为5 μg/kg。因此，如何实现赭曲霉毒素A的高效、安全降解与脱毒，对保障食品安全和人类生命健康具有重要意义。
图1.（A）赭曲霉毒素A污染的农作物；（B）ADH3催化赭曲霉毒素A的水解反应。
揭示ADH3高效水解赭曲霉毒素A的机制
生物酶催化赭曲霉毒素A分子内的酰胺键水解，生成无毒性的苯丙氨酸和赭曲霉素α（图1B），是目前公认的最有效的赭曲霉毒素A脱毒途径，具有特异性强、安全性高、营养损失小等特点，也是当前赭曲霉毒素A脱毒研究的热点。
然而，目前发现的参与赭曲霉毒素A水解脱毒的羧肽酶、脂酶、蛋白酶的催化效率较低，难以推广使用。2022年，中国的研究团队从一株高效降解赭曲霉毒素A的嗜酸寡养单胞菌中，筛选获得一个迄今最为高效的赭曲霉毒素A水解酶ADH3，ADH3对赭曲霉毒素A的水解活性较之前报道的羧肽酶、脂酶等高约50～30000倍。
ADH3三维结构和底物作用方式如何决定其对赭曲霉毒素A的高水解效率？如何进一步设计和分子改造ADH3，以进一步提升其对赭曲霉毒素A的催化性能？为了阐明上述关键科学与应用问题，郭瑞庭教授团队通过单颗粒冷冻电镜技术解析了分辨率为2.5 Å的ADH3与赭曲霉毒素A的复合体结构，揭示了ADH3与赭曲霉毒素A的结合模式与分子作用机制（图2）。
图2.（A）ADH3与赭曲霉毒素A的复合体结构，ADH3为八聚体；（B）ADH3与赭曲霉毒素A的氨基酸作用网络。
设计改造ADH3使水解效率提升4倍
在获得了ADH3与赭曲霉毒素A的精细三维结构模型后，郭瑞庭教授团队进一步对ADH3与赭曲霉毒素A的结合口袋进行结构分析与理性设计，通过对氨基酸位点S88、L218和V357进行突变，以增强ADH3与赭曲霉毒素A之间的亲水作用力或者芳香环堆积力，最终成功获得了一个对赭曲霉毒素A水解效率大幅提升4倍的突变体蛋白ADH3-S88E（图3）。
图3.ADH3理性设计与分子改造
在成功获得了酶活提高近4倍的ADH3-S88E突变体后，郭瑞庭团队进一步以毕赤酵母（食品安全级工业表达菌株）为底盘细胞，构建了高效分泌表达ADH3和ADH3-S88E突变体的重组毕赤酵母菌株。酶活测试发现在毕赤酵母和大肠杆菌两套表达系统中，表达的ADH3和ADH3-S88E酶活相当（图4）。“接下来我们还将进一步对毕赤酵母进行蛋白表达量筛选和发酵条件优化，开展ADH3-S88E在不同应用场景下的赭曲霉毒素A水解脱毒工艺优化研究，为谷物原料中的赭曲霉毒素A脱毒研究提供高效的酶制剂。”本文第一作者戴隆海副教授表示。
图4.大肠杆菌和毕赤酵母表达的ADH3和ADH3-S88E相对酶活比较
据悉，郭瑞庭教授研究团队长期从事环境中有毒有害物质的生物降解酶、萜类合成酶、药物靶点蛋白的结构解析与机理研究，在Journal of Hazardous Materials、Nature Catalysis、Nature Reviews Chemistry、ACS Catalysis、Angewandte Chemie International Edition、JACS、Nature Communications等国际期刊上发表150余篇高水平论文。团队中的戴隆海副教授、硕士研究生牛杜、黄建文副教授为本文共同第一作者，郭瑞庭教授和陈纯琪教授为共同通讯作者。该研究工作获得湖北省杰出青年基金、面上项目、洪山实验室开放课题重点项目和绿色制造国家重点专项资助。
论文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304389423011196?via%3Dihub
（审稿：谢玉平）
